第 1 步：实验设计
在设计活细胞成像实验方案时，请参考辅助小工具和资源仔细考虑每一个步骤。
活细胞成像的优点

• 可以观察动态细胞过程的发生
• 能使用多色检测同时对几个细胞过程和细胞功能进行研究和成像
• 可研究细胞在其原生环境中的结构，从而获得更接近体内环境的更真实结果
• 实现随时间追踪细胞生物分子和结构
• 可观察细胞之间的相互作用
• 让细胞酶和其他胞质生物分子保留在细胞中

活细胞成像需考虑的事项

• 必须有一种特定的方法来以小的毒性标记您的研究靶标-无论是分子、细胞功能还是细胞状态
• 活细胞通常对于某些大的检测分子是不可透过的，例如抗体
• 移动的目标会更难保持聚焦
• 使用的某些技术是否可能对活细胞有害
• 细胞必须保持其自然生理状态

第 2 步：细胞培养
在最佳条件下维持或培养细胞。

在各种实验操作、标记检测和成像观察过程中一直保持细胞存活和健康并非易事。对于延时成像和细胞长时间暴露于周围环境条件下的实验，培养基的选择尤为重要。若要获得可靠的活细胞成像实验结果，非常重要的一点是：细胞必须健康并保持存在尽可能接近生理温度、pH、氧气水平及其他条件的环境中。

第 3 步: 细胞标记
用特异性染料和荧光标记试剂靶向标记细胞结构、细胞功能和目标蛋白质。

应选用合适的荧光染料（特异性靶向的荧光蛋白或小的膜通透性试剂）来检测目标细胞的结构或过程。可以使用其他荧光染料一起同时检测多个细胞结构和过程，但需要使用Fluorescence SpectraViewer（荧光光谱查看器）检查激发光谱和发射光谱以确保不同荧光染料之间符合最小光谱重叠。切记尽量避免使用过多的荧光标记，因为过多的荧光标记会导致：

• 非特异性染色，背景信号增强
• 出现生理伪影和结构扰动
• 细胞毒性
• 光谱重叠严重

请注意：

• 活细胞结构标记试剂——是为了帮助鉴定细胞成份
• 活细胞功能检测试剂——是为了帮助识别细胞功能和过程

第 4 步：信号优化
尽可能降低背景并保持荧光信号的光稳定性。

通过使用减少细胞外荧光并能增加荧光染料光稳定性的试剂，可以的优化信噪比。能够维持细胞健康同时减少或消除活细胞成像实验中背景荧光的培养基对于活细胞成像来说非常重要。加入适用于活细胞的背景抑制剂也有助于减少细胞外背景荧光，并且不需要额外清洗步骤。可以将活细胞抗淬灭试剂用于样品，以减少荧光染料的光漂白，从而防止多次或长时间曝光导致信号丢失。

第 5 步：成像观察
动态过程的活细胞成像需要长期观察
光照与检测

为了使光毒性最小，推荐选择可以地控制光源的成像系统。尝试使用尽可能低的光强度、曝光时间、波长范围和激发能量来照亮激发细胞，同时维持低背景下的良好信号。使用能够以的荧光染料激发水平提供最高信号的光照。在某些情况下（特别是当您希望长时间成像时），建议使用较短的曝光时间或较低的放大倍数，牺牲分辨率来获得更健康的细胞。

较长时间的活细胞成像可能非常具有挑战性，因为观察目标可能会在实验过程中因移动而失焦。许多显微镜具有自动聚焦功能，可以帮助您保持更长的目标聚焦时间并减少焦点漂移。另外，将细胞培养在恒定温度并保持容器中溶液的体积恒定也有助于解决聚焦漂移问题。

环境控制

许多细胞比较敏感不能允许偏离它们的最佳温度、摩尔渗透压浓度、pH 和湿度。具体要求因您所关注的实验性问题而有所不同。例如，研究细胞生长和分裂的实验与涉及受体激活和钙积累的实验相比可能有不同的要求。一些强健的永生细胞系可以允许短时期的成像或监测，而无需任何环境控制。相反，对于长期成像和检测研究，永生细胞和原代细胞的良好结果通常需要严格控制环境参数。

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在加入了Invitrogen CellTracker Deep Red 染料的 HDFn 细胞培养物中的划痕实验。（A）对照明区域进行重复照明 10 小时。该区域中的细胞呈现出光毒性迹象（细胞活力丧失，因细胞无法生长到划痕处）。（B）对比未照明区域中的细胞发现，有活力的细胞可以生长至划痕上。