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层析柱。材料304/316L不锈钢，柱管卫生级，拆装方便;便于清洗和更换，上下过滤采用不锈钢烧结

网，上面配有液体分配器，下面采用全面积渗透，筛网孔径20μm。柱层析法的分离原理是根据物质

在硅胶上的吸附力不同而使各组分分离。一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物

质不易被硅胶吸附。当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程，吸附力

较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。

硅胶柱层析流动相：

极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇

：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸

一般都是利用极性相似相容原理，看流动相与固定相的极性，大部分是固定相的极性小于流动相，

然后流动相的极性与所要洗脱的物质极性比较接近，从而将物质洗脱下来。

柱层析技术又称柱色谱技术。在圆柱管中先填充不溶性基质，形成一个固定相。将样品加到柱子上

，用特殊溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据样品混合物中各组

分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离。

原理： 柱层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使各组分分离。一般情况下极性较

大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附→

解吸→再吸附→再解吸的过程，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，

移动的距离大，先出柱。

在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂

，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。

一、 吸附层析

1、 吸附柱层析

吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。

2、 薄层层析

薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这

种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。

3、 聚酰胺薄膜层析

聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分

离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键

。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程

，就能导致分离物质达到分离目的。

二、 离子交换层析

离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、

电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进

行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。`

三、 凝胶过滤

凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质

却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

四、 亲和层析

亲和层析的原理与的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每

对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中，特异的废物（S'）才能和一定的酶（E

）结合，产生复合物（E－S'）一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有

亲和力，并产生复合物。而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体（类似底物

）是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L（对

酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等）以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M（如活化

琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的

能力。因此，当把围相载体装人小层析柱（几毫升到几十毫升床体积）后，让欲分离的样品液通过

该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作

用吸附到固相载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了个层析

峰。然后，恰当地改变起始缓冲 液的PH值、或增加离子强度、或加人抑③剂等因子，即可把物质S

从固相载体上解离下来，并形成了第M个层析峰（见图6－2）。显然，通过这一操作程序就可把有效

成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力（其大小有差

异）时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后，可以

重复使用。

　　上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。除此之外，还有一种亲和层析法叫通用性

配体亲和层析法。这两种亲和层析法相比，前者的配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受

体和酶的类似底物等），它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。而后者的配体则一般为简单的

小分子物质（如金属、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善吸附

和脱附条件可提高层析的分辨率。

五、 聚焦层析

　　聚焦层析也是一种柱层析。因此，它和另外的层析一样，照例具有流动相，其流动相为　多缓

冲剂，固定相为多缓冲交换剂。

　　聚焦层析原理可以从PH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。

　　1、PH梯度溶液的形成

　　在离子交换层析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。例如，当使用阴离子 剂进行层

析时，制备PH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是，在梯度仪的混合室（这层析柱者）中装高

PH溶液，而在另一室装低PH极限溶液，然后打开层析柱的下端出口，让洗脱液连续不断地流过柱体

。这时从柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低变化的。而在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交

换剂时，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团，故PH梯度溶液可以自动形成。例如，当柱中装阴

离子交换剂PBE94（作固定相）时，先用起始缓冲液（配方见表了一2）平衡到PHg，再用含PH6的多

缓冲剂物质（作流动相）的淋洗液通过柱体，这时多缓冲剂中酸性的组分与碱性阴离子交换对结合

发生中和作用。随着淋洗液的不断加人，住内每点的PH值从高到低逐渐下降。照此处理J段时间，从

层析柱顶部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦层析柱中的PH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的

，但是随着淋洗的进行，PH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的PH却由9逐渐降至6，并恒定于此

值，这时层析柱的PH梯度也就消失了。

　　2．蛋白质的行为

　　蛋白质所带电荷取决于它的等电点（PI）和层析柱中的PH值。当柱中的PH低于蛋白质的PI时，

蛋白质带正电荷，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的PH值是随着淋洗

时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境PH高于其PI时，蛋白质由带正电行变为带负电荷，并与阴

离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境PH 再次低于PI时，它又带正电荷，并从交

换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就在各自的等电

点被洗下来，从而达到了分离的目的。

　　不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出

来的先后次序是按等电点排列的。

工业化生产用层析柱，它涉及一种应用生物制药、食品加工中的分离纯化设备，具体涉及一种新型

工业化生产用层析柱。它能克服现有技术的弊端，减少劳动力，降低劳动强度，降低成本。