ELISA测定一般遵循以下步骤：固相包被→加样品→温育→洗涤→加酶结合物→温育→洗涤→加底物→温育→显色→终止显色→比色

正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线zui高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，*较呈直线的部分是的检测区域。

目前各种形式的ELISA自动分析仪已经进入市场,如广泛应用于血站系统的微板式全自动酶免分析仪,其试剂为开放式的,而对于其它类型的,则试剂和仪器往往是配套的。但当前大部分医学实验室均采用手工操作加仪器测定的方式。ELISA操作步骤复杂,操作不当将引起较大的误差。以下叙述各个步骤中的影响因素。加样器是一种比较精密的工具,其在长时间使用时会因机械磨损或者推动杆内附着血痂等原因造成加样不准,尤其是对于样本量较大的临床实验室,因此必须定期对加液器进行维护和校准。每次加不同的标本时均需更换吸嘴,以免发生交叉污染。加样时速度不可太快,避免将标本加在孔壁上部,并注意不要溅出或产生气泡。加样时还应当注意操作时差对结果的影响,操作时差是指加入标本、试剂及混匀时间的差异。远慕生物供应：操作时差在每个实验中都存在,尤其是手工操作,日常检测标本多达几百个,从加入*个标本到zui后一个标本,需几十分钟,加入试剂及混匀等均存在着前后时间差异,使抗原抗体反应和酶促反应时间不一致,操作时差对竞争法检测的结果影响更大,在加酶结合物和底物时可用定量多道。

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