培养基灭菌有物理法和化学法，其中较多使用、而且效果好、效果稳定的是物理法的热力灭菌法。现介绍几种常用的方法。
一、高压蒸汽灭菌：要求有高压蒸汽锅，技术指标zui高温达摄氏140度或2公斤/平方厘米压力。物品在密闭容器内，水经过加热产生高压蒸汽而提高温度达到杀菌的目的。一般培养基可用摄氏121度保持20分钟即可达到灭菌效果，已经把菌丝营养体、孢子、芽孢全部杀死。但如果基质内含有葡萄糖、马铃茨、豆芽汁、维生素等物质则应用摄氏115度保持20分钟为宜，否则过高温度会破坏营养物，而产生有毒物质不利于食用菌生长。木屑、蔗渣、棉籽壳、麦粒、草料、粪干等物质原来含菌量较大而且含水量较少，宜用摄氏129度保持12.5小时灭菌。
二、常压蒸汽灭菌：物品在锅内以常压蒸汽进行灭菌。通常蒸汽温度为摄氏95105度，因此灭菌的时间要求68小时才能达到效果。这种方法适合人力，燃料充足，未有能力购置高压蒸汽锅的地方使用。这种方法对保持培养基的养分较好。
三、间歇性灭菌法：对不宜超过摄氏100度高温的物品较好。培养基置锅内经摄氏100度高温蒸1小时，杀死杂菌的营养体，保温在摄氏2530度24小时，残留的孢子萌发成营养体。进行第二次蒸煮1小时，把萌发的孢子杀死。同法，进行第三次蒸煮1小时，保温等做法，即可达到*灭菌的效果。
四、过滤除菌：一些不耐高温的物品经过机械阻留的技术把杂菌除去。如血清、维生素、氨基酸等物多用此法除菌。要求设置抽滤瓶和空气压缩机才能进行。
