1、内标对荧光定量PCR仪的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则 PCR 反应变为双重 PCR，双重 PCR 反应 中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
2、荧光定量 PCR 无需内标定量
荧光定量PCR仪技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环 均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品 Ct 值的计算，根据 标准曲线获得定量结果。实时荧光定量 PCR 无需内标是建立在两个基础之上的：
（1）Ct 值的高度重现性 PCR 循环在到达 Ct 值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此 Ct 值的重现性*，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的 Ct 值是恒定的。
（2）Ct 值与起始模板的线性关系由于 Ct 值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定， 因此，实时荧光定量 PCR 是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。荧光定量PCR仪
