牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)核酸扩增检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

二、原理
该试剂盒适用于检测气管分泌物试子、肺组织等样本中牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)，用于牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)感染的辅助诊断，其检测结果仅供临床参考。

三、试剂盒组成：(40T/Kit)
组份 数量 规格
IBRV反应液(IBRV-qPCR MIX) 1管 800μl/管
核酸提取液(DNA Extraction) 2管 1.5ml/管
酶混合物(Enzymes Mix) 1管 40μl/管
阴性对照(NTC) 1管 250μl/管
IBRV阳性对照(IBRV-PTC) 1管 50μl/管

四、荧光PCR仪器适用范围：
ABI系列、MJ系列、Roche系列，博日系列及其他荧光定量PCR检测仪。

五、储存条件及有效期：
本试剂盒于-20℃以下保存，有效期为12个月。

六、样本采集、前处理与DNA提取
6.1 样本采集
病死或扑杀动物，无菌采集肺病变部位或病变/非病变部位交界处的样品；活动物灭菌棉试子沾取气管分泌物，放入无菌试管中。
6.2 样本前处理：
组织样本：每份组织分别从3个不同的位置称取样本约1g，手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5ml灭菌离心管，8000rpm离心2min，取上清液100μl于1.5ml灭菌离心管。
6.3 DNA提取
6.3.1 对于上述处理好的样本加入等体积的核酸提取液(固体标本加入50μl核酸提取液)，100℃恒温处理10min，13000rpm离心5min，取上清液转移至新的1.5mlEP管，-20℃保存；
6.3.2 DNA的提取也可以采用商业化DNA提取试剂盒。
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接去4μl加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

七、检测步骤：
7.1 试剂的制备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(IBRV-qPCR MIN)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
试剂 每个反应加入的量 N个反应加入的量
荧光PCR反应液 20μl N×20μl
酶混合物 1μl N×1μl
总量 21μl N×21μl
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入21μl荧光PCR反应液，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/阳性对照(IBRV-PTC)4μl，10000rpm瞬时离心10s。
7.2 qPCR反应条件
将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件：
预变性 1循环 94℃ for 2 min
PCR扩增 40循环 94℃ for 15 sec
55℃ for 30 sec
在55℃延伸时收集荧光信号。报告基因：设置为FAM，淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

八、结果分析：
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
8.2 试验成立判断
(1)阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。
(2)阳性对照(IBRV-PTC)：均产生扩增曲线。
(3)以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
8.3结果判定
(1)在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明IBRV核酸阳性。
(2)Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明IBRV核酸阴性。
(3)如果Ct值＞35，判为可以样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
(4)对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行IBRV qPCR检测。如果重复扩增曲线为为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明IBRV核酸阳性；否则判为样本阴性。

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)核酸扩增检测试剂盒(PCR-荧光探针法)